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技術(shù)支持

醫(yī)用真空冷凍干燥機(jī)：血小板凍干再水化的條件及其凝血功能變化

血小板(plaet)是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生并釋放于血液循環(huán)中的zui小細(xì)胞,在止血和凝血過程中發(fā)揮著重要的作用。由于血小板保質(zhì)期較短，臨床輸注需求量大，加之臨床輸注需求時(shí)間的不確定性，造成了血小板過期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難尷尬局面。目前國內(nèi)血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為 5d。此外血小板還可深低溫冰凍保存，但這種方法的保存效果和臨床療效不確切。冷凍干燥技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種生物材料的保存，凍干制品具有常溫下保存、性能穩(wěn)定、便于運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測(cè)其凍干再水化后凝血功能的變化，為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 血小板來源實(shí)驗(yàn)組選擇體檢合格，一周內(nèi)未服用阿司匹林等抗血小板**的自愿獻(xiàn)血者，用血細(xì)胞分離機(jī)單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存 5d 過期；對(duì)照組選擇新鮮機(jī)采血小板。

1.1.2 主要試劑和溶液海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)；血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 )；海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8)；凍干保護(hù)劑(含 20%海藻糖，1% 牛血清白蛋白，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復(fù)水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。以上試劑和溶液均在有效期內(nèi)。

1.2 主要儀器

醫(yī)用真空冷凍干燥機(jī)、恒溫振蕩水浴、流式細(xì)胞儀、血球計(jì)數(shù)儀、血小板聚集儀

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血小板的凍干保存血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中，將上述懸浮液轉(zhuǎn)移進(jìn)入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h。將孵化后的血小板懸浮液 800g 離心 3min。去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護(hù)液打散重懸，使用血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)血小板在凍干保護(hù)液中的濃度為 1×109個(gè)/ml。將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結(jié)至-40℃，預(yù)凍 2h后，再以 1.5℃/min 對(duì)擱板升溫至-30℃，退火 0.5h，然后進(jìn)入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件 20h，zui后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結(jié)束。凍干的血小板密封保存在室溫。

1.3.2 凍干血小板的水化將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復(fù)水液，將1ml 復(fù)水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品完全溶解于復(fù)水溶液中。

1.3.3 檢測(cè)血小板回收率用血球計(jì)數(shù)儀分別對(duì)凍干前和凍干再水化后的血小板計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計(jì)數(shù)/凍干前血小板計(jì)數(shù)×100%。

1.3.4 檢測(cè)血小板穩(wěn)定性凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定血小板回收率。

1.3.5 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察用掃描電鏡觀察血小板的形態(tài)；分別以戊二醛固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋后制作超薄切片，用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.6 血小板聚集反應(yīng)檢測(cè) 將凍干血小板復(fù)水后轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行洗滌以去除細(xì)胞外保護(hù)劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板，調(diào)整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。用 APACT-2 型血小板聚集儀檢測(cè)凍干再水化后血小板對(duì)四種同濃度誘導(dǎo)劑—凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應(yīng)。

1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測(cè) 用三色流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)凍干再水化血小板表面激活指標(biāo) CD62p和 PAC-1 的表達(dá)，經(jīng)凝血酶激活后測(cè)定 CD62p 和PAC-1 的再表達(dá)。再表達(dá)率=凝血酶處理后表達(dá)率-血小板表達(dá)率1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，組間差異比較用 t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

2.1 血小板回收率及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間血小板計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為 49.36%
文章鏈接：制藥網(wǎng) https://www.zyzhan.com/tech_news/detail/63342.html

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